Tesis - Microbiología (Sin Restricción)

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Browsing Tesis - Microbiología (Sin Restricción) by Subject "ADN"

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    Caracterización de la dinámica de señalización de PhrA en Bacillus subtilis mediante la utilización de biosensores tipo FRET
    (PUCE - Quito, 2018) Naranjo Meneses, Pablo Leonardo; Santacruz Flores, Fernando René
    El género Bacillus comprende algunos microorganismos de importancia clínica e industrial que exhiben la capacidad de producir esporas en condiciones de estrés. El proceso de esporulación demanda un alto gasto energético por lo que es regulado cuidadosamente. En B. subtilis, este proceso está coordinado por la fosfotransferencia KinA-Spo0F-Spo0BSpo0A y el sistema de percepción de cuórum RapA-PhrA. A pesar del amplio conocimiento de ambas rutas, aún existen características no descritas que pueden contribuir al desarrollo de nuevas técnicas de control de la esporulación. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar la señalización de PhrA mediante la utilización de biosensores tipo FRET. Para ello, se probó la sensibilidad y especificidad del biosensor mediante experimentos de FRETfotoblanqueo. Se realizaron ensayos de esporulación con B. subtilis y B. amyloliquefaciens, y se monitoreó la producción de PhrA con el biosensor. Más tarde, se elaboró un modelo de respuesta FRET con la finalidad de implementar el biosensor como una herramienta cuantitativa. Por último, se diseñaron varios mutantes de B. subtilis con alteración en el estado de fosforilación de Spo0F. El biosensor demostró sensibilidad a concentraciones nanomolares y alta especificidad a PhrA. La cepa B. subtilis PhrA-deficiente fue incapaz de esporular. La producción de PhrA en la cepa silvestre de B. subtilis cesó posterior a las tres horas de iniciado el proceso de esporulación. Interesantemente, B. amyloliquefaciens mantuvo la síntesis de PhrA después de la tercera hora y exhibió una eficiencia de esporulación del 100 %. La parametrización del modelo permitió cuantificar PhrA en los sobrenadantes de cultivos esporulantes. Todas los mutantes de las quinasas mostraron la misma eficiencia FRET que la cepa silvestre. En base a los resultados se pudo concluir que el biosensor presenta alta sensibilidad, especificidad y puede utilizarse como una herramienta cuantitativa. PhrA resulta esencial para iniciar el proceso de esporulación e influye en la eficiencia de este proceso. La velocidad de internalización de PhrA depende de la concentración de péptidos competidores, no obstante, no existe competición a nivel de receptor de RapA para PhrA. Por último, la interacción PhrA-RapA-Spo0F es independiente del estado de fosforilación de Spo0F.
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    Optimización de un protocolo de extracción de ADN a partir de sangre bovina hemolizada y coagulada para la detección molecular de Anaplasma spp.
    (PUCE - Quito, 2020) Landázuri Rafael, Tomás Humberto; Estrella Vásquez, Sonia Margarita
    Para la detección molecular de Anaplasma spp. por PCR se requiere de la extracción de ADN eficiente a partir de sangre completa, lo que a su vez depende de la calidad de la muestra de sangre. La falta de capacitación en toma de muestra o su incorrecta conservación conllevan a la obtención de sangre hemolizada/coagulada. Esto dificulta la detección molecular del patógeno, limitando el alcance de una investigación. Para resolver el problema con este tipo de muestra, se adaptó un protocolo de Chelex-100 con modificaciones sobre el volumen de sangre y la purificación del ADN. Se extrajo ADN de 30 muestras de sangre bovina, hemolizada/coagulada, con el protocolo adaptado y dos kits comerciales de extracción de ADN. Se comparó la positividad por PCR de Anaplasma spp. en las muestras obtenidas, determinándose una buena concordancia de resultados entre los tres protocolos de extracción. Adicionalmente, se empleó el protocolo modificado para obtener ADN a partir de 109 muestras de sangre bovina hemolizada/coagulada. De estas, 64% fueron positivas por PCR para Anaplasma spp. El protocolo de Chelex-100 modificado es eficaz para la extracción de ADN a partir de sangre bovina, hemolizada y coagulada. El ADN obtenido con este protocolo permite la correcta detección molecular de Anaplasma spp. por PCR.