Browsing by Author "Moreno Samaniego, Mishell Carolina"

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    Estandarización de ensayos de expresión génica del biomarcador urinario CD3e mRNA en pacientes trasplantados renales
    (PUCE - Quito, 2016) Moreno Samaniego, Mishell Carolina; Troya Zuleta, Ana María
    El trasplante renal es el tratamiento final para la insuficiencia renal. El costo de la cirugía, la dificultad para encontrar un donante compatible y la corta sobrevida que tiene el aloinjerto, lo convierten en un procedimiento de alta complejidad. El rechazo agudo es la causa principal de fallo del aloinjerto en el paciente. El gold estándar es la biopsia renal, un método invasivo cuyo diagnóstico depende de la experticia del profesional. Actualmente, se ha investigado en varios países, la posibilidad del diagnóstico temprano de rechazo agudo mediante un método no invasivo que emplea biología molecular. Entre los marcadores estudiados se encuentra CD3e mRNA, que es un antígeno de membrana que se encuentra en los linfocitos T y en las células NK. Se conoce que en pacientes con trasplante renal existe una alta concentración de linfocitos T reactivos en muestras de orina, mientras que en aquellos que no han presentado ningún tipo de daño renal no se los encuentra. Un posible predictor del rechazo agudo, es la presencia del biomarcador CD3e mRNA en la orina. Optimizar ensayos de expresión génica mediante qPCR del biomarcador a partir de muestras de orina en pacientes post trasplante renal fue el principal objetivo de este estudio. Como gen de referencia se uso a 18S rRNA, por lo cual se optimizaron ambos sistemas. El RNA total fue obtenido de células presentes en el pellet urinario para la optimización del sistema. La muestra fue purificada mediante TURBO DNA-free kit. Posteriormente, se hicieron ensayos para la optimización de la RT-PCR convencional, mediante gradientes de temperaturas para cada gen, siendo la optima 61°C. La sensibilidad analítica de ambos biomarcadores fue de hasta 7x10-3 ng/ul. Para la RT-qPCR la temperatura óptima fue 63°C. La eficiencia de amplificación para CD3e mRNA fue del 70% y 76% para 18S rRNA. Finalmente se realizó una prueba de campo en cinco muestras de orina de pacientes trasplantados y cinco no trasplantados. Donde se comprobó que el marcador de estudio (CD3e mRNA) se expresa solamente en muestras de pacientes con trasplante, mientras que el gen de referencia (18S rRNA) se expresó en todos los pacientes pero con mayor intensidad en aquellos que tenían un trasplante renal.